Topmusicanswers
Решавање проблема са ПЦР и РТ-ПЦР појачавањем
| Проблем | Могући узрок |
|---|---|
| Нема трака на гелу | Време продужења је било прекратко |
| Термоциклер није био на одговарајућој температури | |
| Додатне, неспецифичне траке на гелу | Прајмери су хибридизирани на секундарну локацију на шаблону |
| Контаминација ДНК је унета у прајмере или пуфере |
- Шта узрокује неуспех ПЦР -а?
- Како решавате проблем са ПЦР -ом?
- Шта бисте урадили да ПЦР амплификација узорка не успе?
- Шта се дешава када додате превише прајмера у ПЦР?
Шта узрокује неуспех ПЦР -а?
Обично прва ствар коју истраживачи ураде је окривити неисправан ензим или реагенс када експеримент не успе, али са ПЦР -ом је то мање вероватно да ће бити узрок неуспеха. Чешће су узрок дубљи унутрашњи проблеми као што су дизајн прајмера, параметри термоциклера или неспецифично везивање за друге секвенце шаблона.
Како решавате проблем са ПЦР -ом?
Проверите способност дужине амплификације изабраних ДНК полимераза. Користите ДНК полимеразе посебно дизајниране за дугу ПЦР. Одаберите ДНК полимеразе са високом процесивношћу, које могу појачати дугачке мете за краће време. Смањите температуре жарења и продужења како бисте помогли везивање прајмера и термостабилност ензима.
Шта бисте урадили да ПЦР амплификација узорка не успе?
Ако реакција амплификације не успе и сумњате да је шаблон ДНК контаминиран инхибитором, додајте сумњиви препарат ДНК у контролну реакцију са шаблоном ДНК и паром прајмера који су се у прошлости добро појачали .
Шта се дешава када додате превише прајмера у ПЦР?
Употреба већих концентрација прајмера може имати следеће ефекте: Ако су прајмери способни да формирају димере, повећање њихове концентрације само доводи до стварања прајмера-димера и не побољшава амплификацију жељеног ПЦР производа.
